Методы очистки белков в биотехнологии

Важным компонентом биотехнологических исследований является использование методов белковой инженерии для создания или модификации белков. Эти методы очистки белков оптимизируют свойства белков для конкретных промышленных применений.

Эти методы требуют от ученых выделения и очистки представляющих интерес белков, чтобы можно было определить их конформацию и специфичность к субстрату. учился. Также требуют изучения реакции с другими лигандами (белок, который присоединяется к белку рецептора) и специфическая активность ферментов.

Требуемая степень чистоты белка зависит от предполагаемое конечное использование белка. Для некоторых применений достаточно неочищенного экстракта. Для других целей, например, в пищевых продуктах и ​​фармацевтике, требуется высокий уровень чистоты. Для достижения необходимого уровня чистоты используются несколько методов очистки белка.

Разработка стратегии

Обычно результат каждого этапа очистки белка в некоторой степени потери продукта. Следовательно, идеальная стратегия очистки белка – это стратегия, при которой наивысший уровень очистки достигается за наименьшее количество шагов.

Выбор того, какие шаги использовать, зависит от от размера, заряда, растворимости и других свойств целевого белка. Следующие методы наиболее подходят для очистки одного цитозольного белка.

Очистка комплексов цитозольного белка более сложна и обычно требует применения различных методов.

Подготовка неочищенного экстракта

Первым шагом в очистке внутриклеточных (внутри клетки) белков является приготовление неочищенного экстракта. Экстракт будет содержать сложную смесь всех белков из цитоплазмы клетки и некоторых дополнительных макромолекул, кофакторов и питательных веществ.

Этот неочищенный экстракт можно использовать для некоторых приложений в биотехнологии. Однако, если чистота является проблемой, необходимо выполнить последующие стадии очистки. Экстракты сырого протеина получают путем удаления клеточного мусора, образующегося в результате лизиса клеток, что достигается с помощью химикатов, ферментов, обработки ультразвуком или French Press.

Remove Debris Из экстракта

Обломки удаляются центрифугированием, а супернатант (жидкость над твердым остатком) извлекается. Неочищенные препараты внеклеточных (вне клетки) белков можно получить, просто удалив клетки центрифугированием.

Для некоторых приложений биотехнологии существует потребность в термостабильных Ферменты – ферменты, которые могут выдерживать высокие температуры без денатурации, сохраняя при этом высокую удельную активность.

Организмы, вырабатывающие термостойкие белки, иногда называют экстремофилами.. Простой подход к очистке термостойкого белка – денатурировать другие белки в смеси путем нагревания, а затем охлаждения раствора (что позволяет термостабильному ферменту преобразоваться или повторно раствориться, если необходимо). Затем денатурированные белки можно удалить центрифугированием.

Промежуточные этапы очистки белков

Современные биотехнологические протоколы часто используют преимущества многих коммерчески доступные наборы или методы, которые предоставляют готовые решения для стандартных процедур. Очистку белка часто проводят с использованием фильтров и подготовленных колонок для гель-фильтрации.

Набор для диализа

Следуйте инструкциям набора для диализа и добавьте нужный объем нужного раствора и подождите указанное время, собирая элюент (растворитель, прошедший через колонку) в свежую пробирку.

Хроматографические методы

Хроматографические методы могут применяться с использованием настольных колонок или автоматизированного оборудования для ВЭЖХ. Разделение с помощью ВЭЖХ может быть выполнено с помощью методов с обращенной фазой, ионного обмена или исключения по размеру, а образцы обнаруживаются с помощью диодной матрицы или лазерной технологии.

Осаждение

В прошлом обычной второй стадией очистки белка от неочищенного экстракта было осаждение в раствор с высокой осмотической силой (т.е. солевые растворы). Осаждение белков обычно проводят с использованием сульфата аммония в качестве соли. Нуклеиновые кислоты в неочищенном экстракте могут быть удалены путем осаждения агрегатов, образованных сульфатом стрептомицина или сульфатом протамина.

Осаждение солью обычно не приводит к получению высокоочищенного белка, но может помочь в устранении некоторых нежелательных белков в смеси и путем концентрирования образца. Затем соли в растворе удаляются диализом через трубку из пористой целлюлозы, фильтрацией или гель-эксклюзионной хроматографией.

Различные белки будут осаждаться при различных концентрациях сульфата аммония. Как правило, белки с более высокой молекулярной массой осаждаются при более низких концентрациях сульфата аммония.

Визуализация белков и оценка очистки

Обратное -фазовая хроматография (RPC) разделяет белки на основе их относительной гидрофобности (исключение неполярных молекул из воды). Этот метод очень селективен, но требует использования органических растворителей.

Некоторые белки навсегда денатурируются растворителями и теряют функциональность во время RPC. Поэтому этот метод не рекомендуется для всех приложений, особенно если необходимо, чтобы целевой белок сохранял активность.

Ion-Exchange

Ионообменная хроматография относится к разделению белков на основе заряда. Колонки могут быть подготовлены либо для анионного обмена, либо для катионного обмена. Анионообменные колонки содержат неподвижную фазу с положительным зарядом, которая притягивает отрицательно заряженные белки..

Катионообменная и гель-фильтрация

Катионообменные колонки представляют собой обратные, отрицательно заряженные шарики, которые притягивают положительно заряженные белки. Элюция (извлечение одного материала из другого) целевого белка (белков) осуществляется путем изменения pH в колонке, что приводит к изменению или нейтрализации заряженных функциональных групп каждого белка.

Эксклюзионная хроматография

Эксклюзионная хроматография (также известная как гель-фильтрация) отделяет более крупные белки от более мелких, поскольку более крупные молекулы проходят быстрее через поперечно сшитые полимер в хроматографической колонке. Крупные белки не помещаются в поры полимера, тогда как более мелкие белки попадают в поры полимера, и им требуется больше времени для прохождения через хроматографическую колонку по менее прямому маршруту.

Время элюирования

Элюат (результат элюирования) собирают в серию пробирок, разделяя белки в зависимости от времени элюирования. Гель-фильтрация является полезным инструментом для концентрирования образца белка, поскольку целевой белок собирается в меньшем объеме элюирования, чем был первоначально добавлен в колонку. Подобные методы фильтрации могут использоваться во время крупномасштабного производства белка из-за их экономической эффективности.

Аффинная хроматография и электрофорез

Аффинная хроматография – очень полезный метод для «полировки» или завершения процесса очистки белка. Гранулы в хроматографической колонке сшиты с лигандами, которые специфически связываются с целевым белком.

Затем белок удаляется из колонки промыванием раствором содержащие свободные лиганды. Этот метод дает самые чистые результаты и самую высокую удельную активность по сравнению с другими методами.

SDS-PAGE

SDS-PAGE ( додецилсульфат натрия, используемый с электрофорезом в полиакриламидном геле) связывается с белками, давая им большой общий отрицательный заряд. Поскольку заряды всех белков примерно одинаковы, этот метод почти полностью разделяет их по размеру.

SDS-PAGE часто используется для проверки чистоты белка. после каждого шага в серии. Поскольку нежелательные белки постепенно удаляются из смеси, количество полос, визуализируемых на геле SDS-PAGE, уменьшается до тех пор, пока не останется только одна полоса, представляющая желаемый белок.

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг – это метод визуализации белков, применяемый в сочетании с аффинной хроматографией. Антитела к конкретному белку используются в качестве лигандов в колонке для аффинной хроматографии.

Целевой белок остается на колонке, а затем удаляется промывкой колонки солевой раствор или другие агенты. Антитела, связанные с радиоактивными метками или метками красителя, помогают в обнаружении целевого белка, когда он отделен от остальной смеси..