Эндонуклеазы рестрикции – это класс ферментов, которые разрезают молекулы ДНК. Каждый фермент распознает уникальные последовательности нуклеотидов в цепи ДНК – обычно длиной от четырех до шести пар оснований. Последовательности являются палиндромными в том смысле, что комплементарная цепь ДНК имеет такую же последовательность в обратном направлении. Другими словами, обе нити ДНК разрезаются в одном месте.
Где находятся эти ферменты
Рестрикционные ферменты обнаружены во многих различных штаммах бактерий, где их биологическая роль заключается в участии в защите клеток. Эти ферменты ограничивают проникновение чужеродной (вирусной) ДНК в клетки, разрушая их. Клетки-хозяева имеют систему рестрикции-модификации, которая метилирует их собственную ДНК в сайтах, специфичных для их соответствующих рестрикционных ферментов, тем самым защищая их от расщепления. Было обнаружено более 800 известных ферментов, распознающих более 100 различных нуклеотидных последовательностей.
Типы рестрикционных ферментов
Существуют пять различных типов рестрикционных ферментов. Тип I разрезает ДНК в случайных местах на расстояние 1000 или более пар оснований от сайта узнавания. Тип III разрезает примерно 25 пар оснований из сайта. Оба эти типа требуют АТФ и могут быть большими ферментами с множеством субъединиц. Ферменты типа II, которые преимущественно используются в биотехнологии, разрезают ДНК в пределах распознаваемой последовательности без необходимости в АТФ, они меньше и проще.
Ферменты рестрикции типа II названы в соответствии с видами бактерий, от которых они выделены. Например, фермент EcoRI был выделен из E. coli. Большинство людей знакомо со вспышками кишечной палочки в продуктах питания.
Ферменты рестрикции типа II могут генерировать два разных типа разрезов в зависимости от того, разрезают ли они обе нити в центре последовательности распознавания или каждой цепи ближе к одному концу последовательности распознавания.
Первый разрез будет генерировать «тупые концы» без выступающих нуклеотидов . Последний образует «липкие» или «сплоченные» концы, потому что каждый результирующий фрагмент ДНК имеет выступ, который дополняет другие фрагменты. Оба они используются в молекулярной генетике для создания рекомбинантных ДНК и белков. Эта форма ДНК выделяется тем, что она образуется путем лигирования (связывания) двух или более разных цепей, которые изначально не были связаны друг с другом.
Тип Ферменты IV распознают метилированную ДНК, а ферменты типа V используют РНК для разрезания последовательностей вторгающихся организмов, которые не являются палиндромными.
Использование в биотехнологии
Рестрикционные ферменты используются в биотехнологии для разрезания ДНК на более мелкие нити с целью изучения различий в длине фрагментов между людьми. Это называется полиморфизмом длины рестрикционного фрагмента (ПДРФ). Они также используются для клонирования генов..
Методы ПДРФ использовались для определения того, что отдельные лица или группы лиц имеют отличительные различия в последовательностях генов и паттернах рестрикционного расщепления в определенных областях генома. Знание этих уникальных областей является основой для снятия отпечатков ДНК. Каждый из этих методов зависит от использования электрофореза в агарозном геле для разделения фрагментов ДНК. Буфер TBE, состоящий из трис-основания, борной кислоты и ЭДТА, обычно используется для электрофореза в агарозном геле для исследования продуктов ДНК.
Использование в клонировании
Клонирование часто требует вставки гена в плазмиду, которая является разновидностью фрагмента ДНК. Ферменты рестрикции могут помочь в этом процессе из-за одноцепочечных выступов, которые они оставляют, когда делают надрезы. ДНК-лигаза, отдельный фермент, может соединять две молекулы ДНК с совпадающими концами.
Таким образом, используя рестрикционные ферменты с ферментами ДНК-лигазы, фрагменты ДНК из для создания одной молекулы ДНК можно использовать разные источники.