ПЦР означает полимеразную цепную реакцию, метод молекулярной биологии для амплификации сегментов ДНК путем создания множественных копий с использованием ферментов ДНК-полимеразы в контролируемых условиях. Всего лишь одна копия сегмента ДНК или гена может быть клонирована в миллионы копий, что позволяет обнаруживать с помощью красителей и других методов визуализации.
Разработан в 1983 году. процесс ПЦР позволил выполнить секвенирование ДНК и определить порядок нуклеотидов в отдельных генах. Метод использует термоциклирование или повторное нагревание и охлаждение реакции плавления и репликации ДНК. По мере продолжения ПЦР «новая» ДНК используется в качестве шаблона для репликации, и следует цепная реакция, экспоненциально амплифицирующая матрицу ДНК.
Применяются методы ПЦР. во многих областях биотехнологии, включая белковую инженерию, клонирование, судебную экспертизу (дактилоскопия ДНК), тестирование отцовства, диагностику наследственных и/или инфекционных заболеваний, а также анализ образцов окружающей среды.
В криминалистике, в частности, ПЦР особенно полезна, поскольку она усиливает даже малейшее количество доказательств ДНК. ПЦР также может использоваться для анализа ДНК, возраст которой насчитывает тысячи лет, и эти методы использовались для идентификации всего, от 800000-летнего мамонта до мумий со всего мира.
Процедура ПЦР
Инициализация
Этот шаг необходим только для ДНК-полимераз, требующих ПЦР с горячим стартом. Реакционную смесь нагревают до 94-96 ° C и выдерживают в течение 1-9 минут.
Денатурация
Если процедура не требует инициализации, денатурация – это первый шаг. Реакционную смесь нагревают до 94-98 ° C в течение 20-30 секунд. Водородные связи матрицы ДНК разрываются, и образуются одноцепочечные молекулы ДНК.
Отжиг
Температура реакции ниже до от 50 до 65 ° C и выдерживают 20-40 секунд. Праймеры отжигаются с одноцепочечной ДНК-матрицей. На этом этапе чрезвычайно важна температура. Если он будет слишком горячим, грунтовка может не схватиться. Если будет слишком холодно, грунтовка может плохо закрепиться. Хорошая связь образуется, когда последовательность праймера близко соответствует последовательности шаблона.
Удлинение/удлинение
Температура на этом этапе варьируется в зависимости от типа полимеразы. ДНК-полимераза синтезирует совершенно новую цепь ДНК.
Final Elongation
Этот этап выполняется при 70-74 ° C для 5-15 минут после последнего цикла ПЦР.
Final Hold
Этот шаг не является обязательным. Температура поддерживается на уровне 4-15 ° C, и реакция регулируется.
Три этапа процедуры ПЦР
Экспоненциальное усиление
В течение каждого цикла продукт (конкретный реплицируемый фрагмент ДНК) удваивается..
Стадия выравнивания
Поскольку ДНК-полимераза теряет активность и расходует реагенты, реакция замедляется.
Плато
Продукт больше не накапливается.
